1. 如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？ 

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，**MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。

2. 何時須更換培養(yǎng)基？ 

視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。

3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞。

7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ 

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

8. 細胞之接種密度為何？ 

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

9. 懸浮性細胞應如何繼代處理？ 

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液**另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋**適當濃度， 重復前述步驟即可。

10.冷凍管應如何解凍？ 

取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

11. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO？ 

除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， jue大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 

一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

13.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速？ 

欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細胞死亡。

14. 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 

動物細胞冷凍保存時**常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 

冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， **次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

16.冷凍保存細胞之方法？ 

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C **–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#

17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度？ 

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 

除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

19.應如何避免細胞污染？ 

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之**好方法。

20.如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？ 

原則上：直接滅菌后丟棄之。

當重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。shou先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4.確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。

5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

6.重復步驟4。

7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 

不能。除極有經(jīng)驗之**外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。

22.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？ 

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。

23. 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 

定期(**少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25.為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

26. 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

27. 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？ 

研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。
30.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ 

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有**終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

31.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ 

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有**小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

32.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 
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酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。#p#分頁標題#e#

33.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？ 

用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色細胞是死細胞。

34.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

36.室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？ 

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值。

50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值

4°C	25°C	37°C
8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4	8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8	7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5

37.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細胞的方法，此技術(shù)破壞性**小，生活力**高。通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在**必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。

38.胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

1. 去除培養(yǎng)基。

2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。

3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。

4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。

5. 向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）

6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。

7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。

39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

40.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細胞經(jīng)過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

42. 細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

43. 無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低**少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？

大部分添加物和試劑**多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

46.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?#p#分頁標題#e#

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

47.保存血清**好的方法?

我們建議血清應保存在-5℃**-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清**恰當?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

48. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?#p#分頁標題#e#

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

49. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但**普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝**無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。**好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。

50. 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養(yǎng)ES細胞、平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

51. 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚**通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質(zhì)量!

52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

53. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃**4℃**室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃**37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。
 
 
 
 
 
一、 實驗室環(huán)境的原因
. p4 N) |2 |( s' X% M2 z: V, w. }" I3 W6 J
普通實驗室由于潔凈程度不高，粉塵相對較多，微生物極易充斥到空氣中，
. m6 C) i# ?0 A! a W. p6 W( k進而在培養(yǎng)箱與超凈工作臺之間傳遞細胞時，附著于細胞培養(yǎng)瓶皿上，再經(jīng)過其他途徑污染細胞。 9 p* [' h0 D$ h- P6 V0 G
8 A' y0 `0 V2 t1 y
實驗室中無法做到完全無菌，只能通過清潔衛(wèi)生與消毒措施來盡量減少雜菌的滋生數(shù)量。打掃衛(wèi)生時要注意不留衛(wèi)生死角，清潔徹底。擦拭地板、臺面等，要用配制好的消毒液，常見的有新潔爾滅（又稱苯扎溴銨，使用濃度0.1%）等。實驗室消毒常用紫外燈，簡單方便。另外醋酸熏蒸也很有效果，但是對金屬設備有緩慢的腐蝕作用，應低頻率應用。臭氧、戊二醛等殺菌方式常用于潔凈車間的消毒，對人體機能有所損害，使用時應注意安全。實驗室中要保持空氣干燥，廣東天氣多潮濕，應定期除濕。**好有通風系統(tǒng)，讓空氣流通不渾濁。室溫不宜過高，**好保持在30℃以下。
0 i8 h4 U' H1 Z& H4 ?
: ]8 K& L. X& Q) m! L) N. r二、 試劑溶液的原因
4 v" L8 `! m4 Y
$ }( o* _ @# v! ~/ H; V4 N' x3 W6 d動物細胞培養(yǎng)的試劑溶液主要有培養(yǎng)基、PBS、胰酶消化液。由于PBS為高
$ [( 5 ]6 [* Z6 _壓滅菌，胰酶用量少，較容易控制污染，只需在操作時注意即可。而培養(yǎng)基用量大，本身營養(yǎng)豐富，適合很多微生物生長，采取的又是過濾式除菌，是無菌防控的重點。1 }6 J4 u' k* D. G+ g
/ T, b) D# K0 [/ y8 F& g
過濾通常有濾芯與濾膜兩種功率介質(zhì)。濾芯價格較貴，但能承受較大壓力，一次性可過濾大量體積液體，可以循環(huán)使用。濾膜價格低廉，為一次性耗材，承壓力較小，過濾速度慢于濾芯，一般是0.45um和0.22um孔徑的兩張濾膜配合使用，在過濾過程中容易破裂。技術(shù)中心（研究院）目前采用的是濾膜過濾方式，由蠕動泵提供壓力。在培養(yǎng)基制備過程中，應注意：1培養(yǎng)基粉末應完全溶解，否則易堵塞濾膜，致使壓力過大而使濾膜破裂；2蠕動泵轉(zhuǎn)速要適度，避免產(chǎn)生過大壓力；3過濾后親自拆開濾器，觀察濾膜是否完好。建議在過濾過程中取樣20~40ml裝入培養(yǎng)瓶，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，鏡檢無異常后再使用，可保證安全性。# A: l Y# h$ R* B* j% v* c2 p#p#分頁標題#e#
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三、 器皿的原因2 B0 p1 C. J( u+ E9 h* P( i% h#p#分頁標題#e#
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主要包括藍蓋瓶、移液管、廢液缸、滴管、培養(yǎng)瓶等玻璃器皿，均為可高壓
2 K: O, m, ]- t* B3 a; E物品，在開瓶蓋或使用時注意用火焰灼燒一遍。無菌操作時注意瓶口不要殘留液體，如有殘留，及時用酒精棉球擦拭。技術(shù)中心有的實驗室采用的是一次性培養(yǎng)瓶，效果好，安全性高，但成本也較高。
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' Z3 k& D! k1 L5 H四、 設備的原因
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& w1 R! 5 a! e: t主要包括超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、水浴鍋、電動移液槍等。# O, f, j0 d! u5 f9 w

$ C& M$ N) q9 {* F; E1、超凈工作臺：是我們進行無菌操作的基礎和保障。按無菌風的流向可分為從上向下的垂直風類型和從里向外的水平風類型。目前我部門使用的均為單面垂直風類型超凈臺。超凈臺通過頂層的高效空氣過濾器提供無菌風，保證內(nèi)部的無菌環(huán)境。使用超凈臺應注意：1）高效濾器正常使用壽命通常為一年到一年半，應定期更換。2）每月定期進行超凈臺的無菌檢測，大致方法為：紫外殺菌后，臺面上放置4到5個瓊脂平板，風機開動30分鐘，然后培養(yǎng)1**2天，觀察平板染菌情況；3）避免上風操作：操作中，手或物品盡量避免出現(xiàn)在開蓋溶液的上方，以防止無菌風將雜菌或塵粒吹入溶液中；4）清潔衛(wèi)生：平時我們**注重的是清潔臺面，卻容易忽略其他衛(wèi)生死角。紫外燈管和日光燈管處于超凈臺上方，無菌風會將附著其上的灰塵、雜菌吹下；大多數(shù)超凈臺中的酒精燈表面都是臟的，多為培養(yǎng)基和灰塵的混合物，是超凈臺內(nèi)的**大污染源，卻**易被人忽視。
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1 F o: R& ^1 `/ t T* a% u2、二氧化碳培養(yǎng)箱：為細胞生長提供良好的內(nèi)環(huán)境。需要注意：1）定期更換高效濾器；2）發(fā)生染菌后要對內(nèi)部進行徹底消毒，隔板**好用酒精灼燒或高壓滅菌；3）下部的盛水器中**好加入雙抗。% P% s! G1 b- W. y" c) g# G. r+ Y
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3、水浴鍋：處在開放式環(huán)境下，溫度一般設定在37℃，極易有雜菌在水中滋生，附著在溶液瓶表面帶入超凈臺內(nèi)。要經(jīng)常更換蒸餾水，定期將水溫調(diào)**高溫進行殺菌。* o8 F& L6 u* k3 n9 K5 M) P+ D
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4、電動移液槍：內(nèi)部結(jié)構(gòu)是外膠管、0.22um空氣過濾器、微型電動機。外膠管是移液器和移液管銜接的部位，應時常用75%酒精擦拭。移液操作時要特別注意防止液體倒吸，一旦發(fā)生應立即用酒精擦拭外膠管，更換空氣濾器，才能再次使用移液器。進液的空氣濾器用清水清洗過后，放入干燥箱內(nèi)烘干，經(jīng)檢驗合格后重復使用。
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